NHS活化磁珠

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

NHS-Activated Magnetic Beads 是均匀的，表面覆盖有高密度NHS（N-羟基琥珀 酰亚胺） 官能团的磁珠。磁珠通过形成稳定的酰胺键方式，快速、高效的共价结合任何含有伯胺的配 体(图 1）。本款磁珠可以在偶联条件下快速完成反应（室温 pH 6.5-9 下 15-30 分 钟，4℃ 下 4 小时），且不需要危险化学品。 NHS-activated Magnetic Beads 适于结合大分子蛋白。 Long-arm NHS-activated Magnetic Beads 被推荐用于结合小肽分子， 因为其长臂（21-原子） 的亲水连接基团可以减少位阻现象。 NHS-activated Magnetic Beads 可以地作为亲和树脂进行亲和纯化，将分子、 细胞和 部分细胞提取物进行提炼纯化。在与配体结合后，将磁珠添加到含有目标分子的样品中，然 后混合、孵育、洗涤和洗脱目标分子（图2）。

产品特点及优势：

·预活化即用型磁珠

·便于使用

·在pH7.4，4℃-25℃条件下可以快速偶联

·稳定的共价键，低水平的配体泄漏

·可重复使用的免疫亲和基质

·极低的非特异性结合率

·用途：用于纯化抗体，蛋白质/肽，DNA / RNA;细胞筛选、免疫沉淀

操作步骤

提示：

强烈建议在实验过程中进行滴定优化，以确定每个实验中应用的磁珠数量。该协议可以相应地放大和缩小。避免使用含有 tris 或其他含有伯胺类试剂的缓冲液，因为它们与预期的偶联反应竞争。

1.将适量的珠子转移到离心管中。将管放在磁力分离器上 1-3 分钟。当磁珠沉淀时， 去除上清液。 

2.取下试管，加入 5 倍磁珠溶液体积的 PBS 缓冲液，通过震荡重新悬浮磁珠，涡旋 30 秒。将试管至于室温环境 1-3 分钟，再将管放在磁力分离器上 1-3 分钟。当磁珠沉淀 时，去除上清液。 

3.重复步骤 2 两次。 

4.向含有目标蛋白质的粗样品中添加洗涤过的磁珠，并在室温或所需温度下温浴 1-2 小时 （温度越低，培养时间越长）。提示：强烈建议进行滴定实验以优化培养时间。因为孵化 的时间太长可能会导致很高的背景。 

5.用 5 倍磁珠体积的 PBS 缓冲液或 1M NaCl 清洗磁珠，直到 280nm 处洗脱液的吸 光度接近背景水平（OD 280<0.05）。提示：添加更高浓度的盐、非离子洗涤剂和还原剂也 可能会降低非特异性背景。例如，向洗涤缓冲液中添加 NaCl（浓度为 1-1.5 M）、0.1-0.5% 的非离子洗涤剂，如 TritonX-100 或 Tween-20，以及还原剂，如 DTT 或 TCEP（我们通 常使用 3mM）。 6.通过适当的方法，如低 pH（2-4）、高 pH（10-12）、高盐、高温、亲和洗脱或 SDS-PAGE 上样缓冲液中煮沸，洗脱目标蛋白。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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