原因一：竞赛抑制比较显着，应稀释竞赛物；

　　原因二：以下降非特异性反响，使特异性的抗原抗体反响充分体现出来。血清稀释用一般的PBS即可，可加1％的BSA，能有用下降ELISA本底，当然假如你嫌费事我觉得用生理盐水代替PBS关系也不大。不论你是用直接竞赛仍是直接竞赛，血清的稀释倍数肯定要事前断定，但也不必一点点，你做一个预试验即可，挑选OD在1.0左右的稀释倍数，即你的竞赛ELISA中阴性孔OD在1.0，这样作出来的曲线比较敏感。

　　ELISA试剂盒试验稀释血清的过程：

　　先把蛋白稀释必定的倍数，比如说10倍、20倍稀释（这样能够大体断定一个参数），将抗原进行一系列稀释包被微量反响板，再用必定稀释度的阳性参阅血清和阴性参阅血清进行孵育后洗刷，再加酶结合物进行反响，经孵育洗刷后，加底物溶液显色，停止反响后别离测定O.D值，挑选O.D值≥1.0的那个抗原稀释度为zui适包被浓度。一般总是要挑选那个O.D值稍大于1.0，而不挑选小于1.0的抗原浓度。阴性参阅血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参阅血清和阴性参阅血清的O.D值有显着不同。

　　除此之外，ELISA试验中还会遇到各种各样的问题，作为实验者需要及时找出处理的方法，包括：

　　1、洗板：1）采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉；2）反应板过多造成洗板等待时间长；

　　3）采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不*；洗板针堵塞，抽吸不*；洗板不畅，导致洗板效果差。

　　解决方法：1）保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干；2）合理安排，或多用几台洗板机。

　　2、显色：1）加显色剂时溅出孔外造成液体回流；2）显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂。

　　解决方法：1）加样时保持显色剂不外流；2）显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。

　　3、终止：可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。

　　4、读板：如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。所以在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸；尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。