一个实验室得到一个新的细胞株后，首先要把该细胞株培养扩增后冻存起来。细胞冻存首先可以在由于污染等情况丢失细胞时有备份可用，另外几乎所有细胞在培养传代的过程中发生一定程度的变异，为了保持实验结果的一致，一般细胞在培养几十代以后就不能再使用了，需要将冻存的，传代较少的细胞化冻培养再使用。细胞冷冻过程有四个要点：细胞的收获、保护剂的使用、冷冻速率和储存环境。 

1、 细胞的收获

用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。收获用来冻存的细胞开始时方法和平时一样，用 100xg 离心 5 分钟收集细胞再重悬，活细胞记数。稀释或浓缩到细胞保存的最终细胞浓度的二倍(一般是 400-1000 万 细胞 /ml )，加入已经配好的等体积的培养液保护剂混合溶液中轻轻混匀，分装到冻存管，冷冻保存。

2、保护剂的使用

细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。对特别敏感的细胞特别是杂交瘤细胞在冻存时使用 95% 血清和 5%DMSO 可能会好些。保护剂在使用时先用培养液或血清配成最终浓度的2倍，再与等体积的悬浮细胞的培养液混合。

3、细胞冻存的速率

细胞的冷冻速率最适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。通常的操作是把细胞先在-20℃1-2个小时，再放入 -80℃冰箱过夜(如果没有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再转入液氮罐或低于 -130℃的冰箱长期保存。

4、储存环境

细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能最好保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。

注意事项：

1. 细胞冻存原则为“慢冻"，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。当细胞快速冷冻时，水和离子往往会留在细胞中，细胞内冰晶的形成会撕裂和刺穿细胞膜。相反，如果细胞冷冻太过缓慢，则细胞外的水会在细胞内冰形成之前结冰。这允许水通过渗透作用逸出，但增加了可能有毒的细胞内溶质的浓度。因此对于大多数细胞，最佳冷冻速率在每分钟1℃之间。

2. DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。

3. 冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4℃时)，复苏存活率在80%～90%，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

4. 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液。

5. DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，冷却后再使用，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。

6. 细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。推荐密度为300-500w/mL。

7. 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒。