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实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。通常我们会重点关注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。其原理如下：
1、TaqMan荧光探针：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成全同步。
2、SYBR荧光染料：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加全同步。
荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
我们将这条荧光扩增曲线人为地分为基线期、指数扩增期和平台期三个阶段:
1、基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所覆盖，我们无法判断荧光强度的变化。
2、扩增期，荧光信号呈指数增长，扩增产物的量与起始模板量存在线性关系，在此阶段可定量分析。
3、平台期，由于底物耗尽等因素.荧光信号不再呈指数增加。
RT-qPCR原理的三个主要步骤：
1 反转录：
使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。
该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。
反转录过程中使用特定引物。
2 、PCR扩增：
使用特定引物对cDNA进行PCR扩增，这些引物环绕目标区域。
PCR是一个循环过程，呈指数级扩增DNA模板的数量。
PCR反应中包含荧光染料或探针，它们结合到扩增的DNA序列上并发出荧光信号。
3 、荧光实时检测：
使用实时PCR仪器实时监测荧光信号。
荧光的数量与每个PCR循环中扩增的DNA数量成比例。
使用专业软件分析数据以确定循环阈值（Ct）值，该值表示荧光信号达到特定阈值水平所需的循环数。Ct值用于计算原始样品中存在的目标DNA量，从而允许进行基因表达或病毒载量等定量分析。
实时荧光定量PCR技术中有几个重要的概念，包括扩增曲线、基线、荧光阈值和域值循环数。
1、扩增曲线（amplification curve）:
是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。
2、基线（baseline）：
是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。
3、荧光阈值（threshold）：
是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。
4、阈值循环数:
表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。
