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ELISA又称酶联免疫吸附测定,是定量检测体液中各种靶标蛋白含量的常用方法。其呈色反应可进行定性或定量分析,利用HRP酶催化TMB,反应产生蓝色亚胺溶液,加入终止液后,使蓝色阳离子转变为黄色的联苯醌。除了常见的蓝色和黄色,ELISA实验过程中,也会出现一些不同寻常的多样色彩。
一、墨绿色 / 深蓝色
例:加入底物溶液孵育后,酶标板孔溶液变成墨绿色或深蓝色。
在正常的ELISA实验中,加入底物溶液孵育后,标曲前四孔出现明显蓝色梯度,即可终止反应。但是,当孵育的HRP酶结合物工作液浓度过高,或样本浓度远高于检测范围时,标曲最高1-2个梯度孔或样本孔可能会呈现墨绿色或深蓝色。
墨绿色样本终止反应后,在450nm波长下读取的OD值可能会比实际要低;深蓝色标曲会由于梯度OD值过于接近,无法拟合得到有效标曲并准确计算样本浓度。
建议:
(1)严格控制每一步的孵育温度和时间,按照说明书要求制备HRP酶结合物工作液;
(2)在显色阶段,通过前四孔出现明显蓝色梯度来控制显色时间;
(3)浓度过高的样本需要稀释到试剂盒检测范围内,再进行测定。
二、黄色
例:终止反应后,整板变成黄色。
可能原因:
1 竞争法按照夹心法操作:两者原理不同,操作步骤不同,请注意区分。
2 洗涤不当:甩板时离废液桶太近,导致液体反溅;甩板不干脆,导致液体残留或流入其他孔;洗涤时每孔注入的洗液不够,或洗涤次数不够;液体过多溢出污染;浸泡时间过短;
3 显色剂保存不当,或孵育时未避光,造成非特异性显色;
4 孵育温度过高,或孵育时间过长;
5 不同试剂盒组分混用或替代,产生基质效应或非特异性吸附,导致假阳性结果。
三、标曲正常,样本孔全黄
读值计算后,发现标曲拟合效果良好,但样本OD超过标曲最大OD,表明样本还需要稀释哦。
四、 黑色
例:加入终止液后,酶标板孔中液体变黑,或产生黑色沉淀。
可能原因:
1、HRP酶浓度过高:准备HRP酶工作液时,保证计算和配制体积准确,按照说明书中的洗涤体积、时间、次数进行洗板;
2、样本中指标浓度过高,样本还需要稀释;
3、终止液中硫酸浓度过高或变质:终止液是1M H2SO4,混用过高浓度的硫酸可能导致炭化反应。