逆转录（reverse transcription）实验作为是常见的分子生物学实验之一，逆转录是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板。虽然看上去步骤简单，但是逆转录实验中实际操作时常出现问题如下：

1. 如何提高 RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？

① 确定模板 RNA 完整性好，无 DNA 污染。

② RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂。

③ 使用适量的模板 RNA ，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

④ 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

2.  RNA 中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？

逆转录抑制剂包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等等。可将已确定的高质量 RNA 模板同样品混合，同高质量 RNA 模板比较产量以检测 RNA 抑制剂；若高质量模板 RNA 与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

3. 逆转录后的 qPCR 实验 Ct 值偏大或者普通 PCR 产量低。

① RNA 模板质量差，需要重新制备 RNA 模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。

② 逆转录后的 cDNA 中含有高浓度的模板 RNA 和逆转录试剂成分，可能会对后续的PCR 产生抑制作用，所以可以适当梯度提高 cDNA 稀释比例（通常来说可将 cDNA 原液稀释5-10倍，其*佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在20-30个循环为好）。

③ 起始的 RNA 模板量低，需要减少稀释倍数或增加 RNA 模板量。

④ 基因本身原因（复杂和长度），可以重新设计复杂基因的引物，避免复杂结构。或者用三步法程序或延长两步法程序的延伸时间。

⑤ 逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比实验，对比逆转录产品性能。

4. 逆转录酶扩增效率评估，应该关注哪些指标？

建议： qPCR-ct 值，或者 PCR 产量

如果想比较逆转录性能，尤为直接的还是后续做 qPCR 或者 PCR 平行对比实验，这种方法相对较为准确。

不建议：cDNA 中间产物浓度测定 or 其他方法。

逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生 RNA-cDNA 杂交链，溶液中的 RNA 和部分 DNA 会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不准确，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的试剂盒进行对比实验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。

优化及注意事项：

1、 逆转录 PCR 时，提取 RNA 是关键，需分离高质量 RNA（纯度和完整性）。

2、 整个操作过程需使用去 RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。

3、 逆转录过程中要谨防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制剂。

4、 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

5、 逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。

6、 提高逆转录预热温度（也可根据相应逆转录试剂盒进行调整）。

7 减少基因组 DNA 污染，可使用去基因组的逆转录试剂盒。